外泌体的提取与鉴定

外泌体（Exosome）是一种由活细胞分泌，直径在30-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中；外泌体携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
 

外泌体提取

样本预处理与外泌体分离、保存：

外泌体存在于人类或动物的各种体液中，我们可以选择不同的样本来源进行相关的外泌体研究。由于外泌体是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体，分布于胞外基质。为了获得高纯度的外泌体，必须确保有效去除所有的细胞碎片及其他不需要的杂质。

外泌体的分离方法通常包括密度梯度离心、差速离心、体积排阻、免疫分离、聚合物沉淀以及试剂盒等方法。

注意事项

1、根据样本的不同，选用不同的外泌体提取方法；

2、避免外泌体中内容物降解好变性，所有操作尽量在4℃条件下进行；

3、避免外泌体膜结构破坏，操作中尽量减少外泌体的压力和剪切力，比如使用钝化的枪头等。

外泌体鉴定

MISEV2018（细胞外囊泡杂志）对外泌体的表征规定了最小试验要求：

① 总体表征：

至少3个阳性（至少包括1个跨膜蛋白和1个细胞溶质蛋白）、1个阴性蛋白质标志物。

② 个体表征：

电镜或原子力显微镜、单颗粒追踪两种方法互为补充。

1、电镜检测

透射电子显微镜观察法（TEM）是从形态和大小上对外泌体进行鉴定。通过负染的方法，在高倍放大下直接观察单个外泌体的形态结构和大小。

样本要求：BCA浓度300-400ng/μl，体积10μl；避免反复冻融，4℃保存，冰袋运输。

2、粒径检测

粒径分析是从整体上对外泌体大小的分布情况进行检测，具有准确、快速、重复性好等优点，是对现有外泌体鉴定方法的良好补充。

样本要求：避免反复冻融，4℃保存，冰袋运输。

3、Western Blot检测

Western blot是通过抗原抗体特异性结合的原理，对外泌体标志蛋白进行检测，从蛋白质层面对外泌体进行鉴定。常用的外泌体标志蛋白包括CD63、TSG101及Alix等。

样本要求：血浆样本BCA量60ug，＞0.5μg/μl；细胞上清BCA量40μg，＞0.5μg/μl；冰袋运输。