数字PCR新方法测量端粒长度

                                                                                         
端粒长度的异常往往与多种衰老相关疾病有关，比如糖尿病、神经退行性疾病和心血管疾病，还与多种癌症的预后相关。目前，测量端粒的金标准方法需要大量的起始DNA，而且操作繁琐，不适合临床使用。

 

新加坡国立大学的研究人员近日设计了一种名为单端粒绝对长度快速分析（STAR）的新方法，能够快速测量端粒的绝对长度。他们在《Science Advances》杂志上报告称，该方法准确灵敏，并且能够测定癌细胞中的染色体外端粒重复序列（ECTR）。

 

“我们希望这种简单而全面的检测方法将被广泛地采用，作为端粒检测的标准方法，”研究人员在论文中写道。

 

研究人员指出，评估端粒长度的现有方法存在缺陷。例如，基于Southern blotting的末端限制性片段（TRF）分析一直被认为是端粒测量的金标准方法，但因太过繁琐而不适合临床使用。此外，实时定量PCR分析只能提供端粒长度的相对测量值，而荧光原位杂交只能评估处于分裂中期的积极分裂细胞。

 

他们此次开发的STAR方法是利用数字PCR技术对样本进行分液，然后在纳升级区室内测定端粒重复序列的长度。在此过程中，他们采用Fluidigm的48.770数字芯片和Biomark HD系统（48.770代表可运行48个样本，每个样本分成770小份进行数字PCR分析）。

 

PCR扩增导致PCR产物的增加与端粒重复片段的初始长度或拷贝数成正比。PCR产物的增加体现在荧光强度的变化中。通过对荧光信号的实时监测，研究人员可捕获产物变化。

 

此外，他们还用EvaGreen染料来取代经典的SYBR Green I染料，并对退火温度和引物浓度进行了调整。同时，为了测定端粒的绝对长度，他们利用已知长度的合成端粒生成了标准曲线，并根据该标准曲线来计算其他端粒的长度。

 

研究人员利用一组癌细胞验证了STAR分析，并与TRF和其他方法的结果进行了对比。他们报告称，通过STAR分析测得的端粒平均长度与金标准的TRF方法高度相关，这表明STAR分析是测量端粒绝对长度的可靠方法。而且，处理时间减少了三个小时。

 

之后，他们又利用STAR分析来定量染色体外端粒重复序列，这是癌细胞的一种特征，它利用同源重组机制来维持其端粒。他们对四个儿科的成神经细胞瘤样本进行了分析，发现两个样本呈阳性，两个样本呈阴性，与其他研究的结果一致。这表明肿瘤实验室可采用STAR分析来确定端粒的维持机制。

 

“随着临床实验室广泛采用数字PCR检测方法，并引入商业化的高通量数字PCR平台，我们希望STAR分析可成为测定端粒长度的新模式，”研究人员在文中写道。