构建表达克隆：标签种类繁多，该如何选择？

一、融合标签的应用是什么？

蛋白纯化

标签蛋白在大肠杆菌中表达，细菌裂解物经亲和层析，标签蛋白则会结合在层析柱上，最后将标签蛋白从层析柱上洗脱下来以达到蛋白纯化的目的。小分子6XHis Tag常被用于细胞内源蛋白的纯化和大肠杆菌的蛋白纯化。另外，针对哺乳动物细胞中的小标签有FLAG®（D-Y-K-D-D-D-D-K），分子量稍大的标签有Glutathione S-transferase (GST) 或Maltose Binding Protein (MBP)。

WesternBlot检测

FLAG® Tag以其分子量小以及拥有许多与之匹配的商业化的抗体等优势，成为Western Blot实验中常用的Tag。其他，如6XHis, C-Myc, HA, HaloTag®亦可用于Western Blot。

免疫沉淀反应

确保蛋白不变性的情况下分离天然蛋白需选择Pull-down tag。FLAG® Tag 其分子量小以及拥有大量相匹配的商业用抗体等优势成为免疫沉淀反应中最常用的Tag。其他常用的标签有：HA 和cMyc。

活细胞成像

活细胞成像常用荧光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）作为标记蛋白,其中最常用的是绿色荧光蛋白（GFP）和它的衍生物（CFP, YFP, etc.），以及一些红色变体，如dTomato和mCherry。FP 标签使研究者能够在荧光显微镜下观察活细胞，或通过流式细胞术（FACS）分离活细胞。

HaloTag®，一种可与多种配体结合的小分子量标签荧光蛋白。一种标签可与不同的配体结合，若结合的配体是荧光染料，可生成不同波长的荧光。许多标签不止一种用途,但适用性则有强有弱。

二、融合标签的影响

任何一类标签都具有影响目的蛋白表达或功能的可能性。首先，标签可能会干扰蛋白的正确折叠，致使目的蛋白失活或形成包涵体。其次，标签可能会中断亚细胞定位信号，即使蛋白能够正确翻译和折叠，但在细胞内所处的位置是错误的。

在某些情况下，为了减少标签对蛋白功能的干扰，最终需要切除标签。将融合标签与目的蛋白分离可减少融合标签的潜在负面影响，这种分离可通过两种方式来实现。

向同一个转录本上的两个ORF间插入核糖体进入位点（IRES），以实现蛋白的独立翻译。

通过2A多肽分离蛋白，2A多肽处于目的蛋白和标签之间。

三、N-端还是C-端标记？

选择在N-端还是C-端加标签需要考虑以下几个因素：

首先，不应选择蛋白核心区，以确保在非变性条件下能够结合抗体或其他配体。

其次，标签不能靠近蛋白功能结构域，以最大限度地减少其对蛋白自然活性的干扰。

再者，许多蛋白具有N-端定位信号。将标签至于N-端将干扰信号序列的功能，最终导致无法正确定位；或者，定位信号序列在翻译后阶段被移除时，标签也跟着丢失了。

除了以上所述，N-端或C-端标记的选择还需要根据蛋白结构、定位等特性。然而，倘若你没有确切的蛋白结构，或蛋白功能域图谱，建议分别构建N-端标记和C-端标记的表达克隆，以检测哪个更有效。

GeneCopoeia不但提供150多种标签和标签组合的表达克隆，还提供无标签的表达克隆。无标签ORFs最重要的优势是保持了蛋白的天然结构。当您确实需要添加蛋白标签到表达载体时，可根据实验需要选择合适的标签。下表是GeneCopoeia过表达克隆中所使用到的部分标签及其应用。